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摘要 : Protein表达是一个非常复杂的过程,因此很难预测表达的蛋白是否是可溶性的、包涵体形式还是部分降解的。为了预防各种可能的困难条件,在重组蛋白上导入两种Tag可以提供获得高纯度均质蛋白的灵活性。 蛋白含有两种不同亲和纯化Tag的重要原因: 纯化全长的蛋白 获得最高纯化的蛋白 适合变性或生理条件下纯化 优化的操作过程,可以直接从培养基中纯化蛋白 与Strep-tagreg;配合
Protein表达是一个非常复杂的过程,因此很难预测表达的蛋白是否是可溶性的、包涵体形式还是部分降解的。为了预防各种可能的困难条件,在重组蛋白上导入两种Tag可以提供获得高纯度均质蛋白的灵活性。

蛋白含有两种不同亲和纯化Tag的重要原因:
纯化全长的蛋白
获得最高纯化的蛋白
适合变性或生理条件下纯化
优化的操作过程,可以直接从培养基中纯化蛋白

与Strep-tag®配合最有效的是6xHistidine-tag,总之推荐一个Tag在蛋白的N-端,另外一个Tag在蛋白的C-端。

纯化全长蛋白:

重组的蛋白在表达时会有部分降解,即使在下游的处理过程中加入蛋白酶抑制剂也无法避免。可溶性降解蛋白仍然带有纯化tag,在纯化时会引起纯化蛋白的不纯(由于有不同长度片段的蛋白混入)。这种问题可以通过在蛋白的另一端加入第二种Tag来解决。经过第二种Tag的纯化,即可获得全长的蛋白。

最高纯度的蛋白:

在生理条件下,Strep-tag纯化可以将重组蛋白的纯化提升到约99%。由于重组蛋白特性不同,纯化的高低也有差异。尽管可以通过更改纯化树脂来解决该问题,但是采用第二种纯化Tag是目前最有限的方法。尤其对于结晶学研究、免疫和高通量分析,高纯度蛋白的获得非常重要。

适合变性或生理条件下纯化:

很难预测表达的重组蛋白是可溶性还是形成包涵体,这由启动子的强度和蛋白自身的折叠速率所决定。如果蛋白是可溶性的并具有生理功能,Strep-tag是纯化的最佳选择,因为其可以在生理条件下纯化蛋白从而保持蛋白的生物学活性。如果蛋白以包涵体形式存在,需要加入高浓度的胍盐或尿素使之变性成为可溶以便亲和纯化。在此变性条件下,可以借用6xHistidine-tag的金属鳌合活性分离蛋白。采用Ni-NTA 柱,蛋白还可以重新折叠。如果由必要,可借用Strep-tag在生理条件下纯化重新折叠的蛋白。

直接从培养基中纯化蛋白:

对于高表达的载体(如:昆虫细胞),重组蛋白分别到培养基中是经常采用的表达策略。在此情况下,推荐先采用6xHistidine-tag进行第一步的收集。由于6xHistidine-tag对Ni-NTA
matrix具有极高的亲和能力,通过分批纯化,重组蛋白可以高效收集。作为阳性负对照,生物素与Strep-tag纯化系统不兼容,其通常存在于培养基中,经过6xHistidine-tag的收集,生物素可以除去。如果由必要,可以采用Strep-tag作为第二步纯化以获得更高纯度的蛋白。

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